为什么明明做了抗生素筛选，重组蛋白产量还是如此飘忽不定？ 最新发表在《Current Genetics》的研究揭开了背后的残酷真相：在长时间诱导时，精心构建的pET质粒，绝大多数细胞早就把它丢弃了！

研究背景

pET表达质粒在大肠杆菌中广泛用于重组蛋白的生产，其选择和维持通常依赖于Tn3.1型（编码β-内酰胺酶，赋予对β-内酰胺类抗生素的抗性）或Tn903.1型（编码氨基糖苷-3'-磷酸转移酶，赋予对氨基糖苷类抗生素的抗性）遗传片段。然而，在长时间诱导重组蛋白生产时，质粒的维持效率可能受到宿主菌株和抗生素选择标记类型的影响。本研究旨在探究这两种遗传片段在pET质粒维持中的效率差异，并提出优化策略。

研究方法

研究采用两种常用的pET表达质粒（pET28a和pET15b），分别携带Tn903.1和Tn3.1片段，并在两种常用的大肠杆菌菌株（BL21(DE3)和C41(DE3)）中进行实验。实验设计包括：

结果与分析

图 1 BL21 (DE3) 中 pET 质粒的维持情况：BL21 (DE3) 分别携带 pET28a-sfGFP（Tn903.1）或 pET15b-sfGFP（Tn3.1），且未用 IPTG 诱导。A pET28a 和 pET15b 表达质粒的 schematic 示意图，它们分别携带 Tn903.1（aph，卡那霉素抗性）或 Tn3.1（bla，氨苄西林抗性）片段。突出显示了主要特征。灰色标记区域在两种质粒中的核苷酸序列相同。蓝色标记区域为该表达质粒所特有。B 实验流程示意图（改编自 Cumming 等人，2022）。质粒维持率通过在添加抗生素的液体培养基中培养后，将菌液涂布到含或不含抗生素的 LB 琼脂平板上进行测定。质粒维持率 = [含抗生素平板上的菌落数 / 不含抗生素平板上的菌落数] × 100。C 携带 Tn903.1 和 Tn3.1 的 BL21 (DE3)（在添加抗生素的 LB 培养基中培养）的质粒维持率。D 与 C 组实验相同，不同之处在于细胞用 0.5 mM IPTG 诱导。E 与 D 组实验相同，不同之处在于 BL21 (DE3) 携带的是 pET28a-Mth1（Tn903.1）或 pET15b-Mth1（Tn3.1）。Mth1 是一种潜在的人类癌症靶点，可净化氧化的脱氧核苷三磷酸库（Gad 等人，2014b）。F 与 D 组实验相同，不同之处在于质粒间的抗性盒进行了互换：pET28a-sfGFP（Tn3.1）或 pET15b-sfGFP（Tn903.1）。通过双尾 Student's t 检验得出的统计显著性差异：p

图 2 C41 (DE3) 中 pET 质粒的维持情况：C41 (DE3) 携带 Tn903.1 和 Tn3.1（在含或不含抗生素的 LB 培养基中培养）。A 携带 pET28a-sfGFP（Tn903.1）或 pET15b-sfGFP（Tn3.1）的 C41 (DE3) 在添加抗生素和诱导条件下的质粒维持率。质粒维持率通过在不含抗生素的液体培养基中培养后，将菌液涂布到含或不含抗生素的 LB 琼脂平板上进行测定。质粒维持率 = [含抗生素平板上的菌落数 / 不含抗生素平板上的菌落数] × 100。“n.s” 表示差异无统计学意义。B 与 A 组实验相同，不同之处在于未添加抗生素。通过双尾 Student's t 检验得出的统计显著性差异

图 3 关于丢失质粒的细胞如何影响生物量的解释。  A 在没有重组蛋白生产的情况下，经随机分离后丢失质粒的细胞，与含有质粒的细胞相比，没有可检测到的适应性优势。  B 当诱导 BL21 (DE3) 细胞从含有 Tn3.1 的 pET 质粒（并通过氨苄西林筛选）中生产重组蛋白时，生物量中含有大量丢失质粒的细胞。与含有质粒的细胞相比，丢失质粒的细胞具有可检测到的适应性优势；且由于氨苄西林在培养基中留存时间较短（用红色区域表示），这些丢失质粒的细胞不会被筛选淘汰。  C 当诱导 BL21 (DE3) 细胞从含有 Tn903.1 的 pET 质粒（并通过卡那霉素筛选）中生产重组蛋白时，生物量中仍含有一定比例丢失质粒的细胞 —— 尽管卡那霉素在培养基中留存时间较长（用红色区域表示）。这种情况发生的原因尚不明确，但可能与群体保护有关。与那些含有质粒却对生物量无贡献的细胞相比，这些丢失质粒的细胞没有可检测到的适应性优势。  D 当诱导 C41 (DE3) 细胞从含有 Tn3.1 的 pET 质粒（并通过氨苄西林筛选）中生产重组蛋白时，丢失质粒的细胞不会大量积累，因为与含有质粒的细胞相比，它们没有可检测到的适应性优势。 E 当诱导 C41 (DE3) 细胞从含有 Tn903.1 的 pET 质粒（并通过卡那霉素筛选）中生产重组蛋白时，丢失质粒的细胞不会大量积累，因为与含有质粒的细胞相比，它们没有可检测到的适应性优势

总结

本文通过详细实验证明，pET质粒维护效率受宿主菌株（BL21(DE3) vs. C41(DE3)）、抗生素片段（Tn3.1 vs. Tn903.1）和诱导时间主导。短诱导下所有条件高效；长诱导下，C41(DE3)无条件维护高效，而BL21(DE3)需依赖Tn903.1和卡那霉素或短诱导。

关键问题及回答

问题1：在长时间诱导（20h）的情况下，pET 质粒在 BL21 (DE3) 和 C41 (DE3) 中的维持效率有何差异？原因是什么？

在长时间诱导（20h）时，BL21 (DE3) 中含 Tn903.1 片段的 pET 质粒维持率约 50%，含 Tn3.1 片段的 < 15%，且无抗生素时维持率 < 10%；而 C41 (DE3) 中无论有无抗生素、片段类型如何，质粒维持率均约 100%。原因是 BL21 (DE3) 中 T7 RNA 聚合酶水平高，重组蛋白生产代谢负担大，且氨苄西林易降解使无质粒细胞增殖，卡那霉素虽持久但也不能完全阻止无质粒细胞积累；C41 (DE3) 中 T7 RNA 聚合酶水平低，代谢负担小，无质粒细胞无生长优势。

问题2：  为什么含 Tn903.1 片段的 pET 质粒在 BL21 (DE3) 中比含 Tn3.1 片段的维持效率更高？

主要因两种抗生素的半衰期不同。氨苄西林在培养基中被 β- 内酰胺酶快速降解（半衰期约 6 分钟），约 70 分钟后就无法选择对抗无质粒细胞，这些细胞因摆脱代谢负担而快速增殖并主导培养物；而卡那霉素在培养 20h 后仍有活性，能持续选择对抗无质粒细胞，使其难以主导培养物，因此含 Tn903.1 片段的质粒维持效率更高。

转载今日头条 媚于言语https://www.toutiao.com/article/7534226255953068563/